La metodologia di analisi


Il test citotossico si basa sull’osservazione della morfologia assunta dai globuli bianchi messi a diretto contatto con un estratto, opportunamente preparato, di ciascun allergene oggetto di valutazione. Sulla base della morfologia assunta l’operatore, opportunamente preparato, riesce a valutare il grado di risposta leucocitaria ed assegna così un “grado di intolleranza”. Primo passo per il laboratorio che esegue il test, è disporre di uno strumento moderno, affidabile e prodotto secondo metodi rigorosi ed allineati alla Normativa Comunitaria (dir 98/79/CE dispositivi medico diagnostici). I kit Allergoline rispettano appieno le direttive della normativa, sono assemblati in ambiente ad atmosfera controllata con vetrini di alta qualità rivestiti in TEFLON® a garanzia di una perfetta delimitazione del campo di lettura e per evitare contaminazioni tra i pozzetti.

La metodica seguita per l’esecuzione del test è quella proposta da Bryan (1960 e successiva del 1967) e consta delle seguenti fasi:

  • 5 ml di sangue sono raccolti in provetta con anticoagulante (citrato di sodio 3,8 g/L) e centrifugati a 1500- 2000 x g per 20 minuti. Si formano due fasi: la parte contenente i globuli rossi in basso ed il plasma in alto. All’interfaccia è presente un sottile strato biancastro in cui sono disposti i globuli bianchi.
  • Mediante pipetta Pasteur monouso, 0,5 mL di materiale vengono raccolti da questa interfaccia prelevando il più possibile leucociti ed in parte le due fasi sopra e sottostante.
  • Il materiale prelevato si trasferisce in una provetta contenente 2,5 mL di acqua e si miscela delicatamente a questa con la pipetta.
  • Singole gocce di tale materiale diluito sono poste a contatto con gli estratti alimentari predisposti sui vetrini.
  • I vetrini sono coperti con gli appositi copri-oggetto e si lascia incubare per 10- 15 minuti.
  • I vetrini sono analizzati ad un microscopio ottico con un ingrandimento finale di 400 volte.

La data di scadenza è indicata sull’etichetta posta sul fondo della confezione, il prodottodeve essere conservato a 2-28°C. I vassoi contengono 20 o 30 (cod. CY-20/30) vetrini di alta qualità pronti all’uso, più un vetrino non sensibilizzato da utilizzare come controllo negativo. Su ogni vetrino, mascherato in TEFLON® (heavycoating) altamente idrofobico, sono presenti due, tre o sei camere circolari di 14 mm di diametro contenenti un estratto alimentare essiccato. Ogni vetrino è numerato in ordine crescente. Il pannello di alimenti attualmente in uso è descritto in calce con la relativa legenda numerica.
Allergoline Biotech & Research produce in proprio gli allergeni necessari per i kit che commercializza. Tali allergeni sono prodotti e dispensati in ambiente e con mezzi idonei a garantirne la massima protezione da ogni tipo di contaminazione.

I pannelli standard comprendono i cibi a maggior diffusione ma Allergoline può produrre pannelli o allergeni speciali per ogni esigenza specifica.

I gradi di intolleranza


Nessuna intolleranza

I globuli rossi sono ben impilati e normocromici, i globuli bianchi hanno forma sferica, la membrana è intatta e rifrangono molto la luce.


Intolleranza di primo grado

 

I globuli rossi sono ancora impilati e normocromici, mentre i bianchi assumono un aspetto amorfo, una colorazione più scura (il citoplasma si vacuolizza e la luce non è più rifranta) e un’accentuata rugosità della membrana che, tuttavia, resta integra.

 


Intolleranza di secondo grado

 

Le emazie iniziano ad ammassarsi e a perdere la caratteristica colorazione rossa, mentre i globuli bianchi, oltre a evidenziare caratteristiche di grado 1, tendono ad avere rotture a livello di membrana con fuoriuscita di materiale citoplasmatico.

 


Intolleranza di terzo grado

Le emazie sono disperse, non più impilate ma disposte orizzontalmente, decisamente “pallide” rispetto a prima. I globuli bianchi sono totalmente rotti, il citoplasma è quasi del tutto fuoriuscito, rimane una mezza luna di membrana e poco più. Si nota anche la presenza di ammassi piastrinici più o meno estesi.

CY30 - 90 alimenti

Pannello CY30

Validità del test leucocitotossico


Dopo anni di perplessità sulla affidabilità e riproducibilità del test citotossico, a dicembre 2014 abbiamo la prima evidenza scientifica sulla sua validità. L’università di Ferrara ha pubblicato sulla prestigiosa rivista “World Journal of Gastroenterology” uno studio controllato randomizzato in cui si dimostra come la dieta di esclusione, stabilita tramite un test leucocitotossico, possa essere un efficace approccio in soggetti affetti da reflusso gastroesofageo.

I vetrini per il test leucocitotossico


I pannelli


CY07 - 21 additivi

CY20 - 60 alimenti

CY20M - 60 alimenti (mediterraneo)

AC13 - 60 alimenti + 17 additivi

AC13M - 60 alimenti (mediterraneo) + 17 additivi

Articolo su PubMed